В настоящее время основным видом обследования мужчин при нарушениях фертильности остается традиционное изучение показателей спермограммы. Ведущими показателями, отражающими оплодотворяющую способность спермы, считаются концентрация сперматозоидов (их общее количество), подвижность и содержание сперматозоидов нормальной (типичной) морфологии. Хотя у фертильных мужчин эти показатели в общем выше, чем у бесплодных, тем не менее, в группе фертильных и бесплодных мужчин они могут значительно перекрываться, позволяя предполагать наличие неких важных, но не учитываемых в традиционной диагностике факторов, влияющих на фертильность. Это означает, что, основываясь только на показателях спермиологического обследования, нельзя дать достоверный прогноз фертильности, учитывающий не только возможность зачатия, но и исход наступившей беременности.
Использование предлагаемого метода количественного электронно-микроскопического исследования сперматозоидов (ЭМИС) может быть информативно при диагностике бесплодия не только в случае отсутствия зачатия, но и, в ряде случаев, при невынашивании беременности, позволяя наметить пути терапии или применения методов вспомогательных репродуктивных технологий.
Области применения ЭМИС:
1) обследование пациентов с нарушениями фертильности для выявления аномалии сперматозоидов, не видимых при традиционном спермиологическиом исследовании при идиопатическом бесплодии.
2) обследование пациентов, у жен которых в анамнезе спонтанное прерывание беременности или неудачные попытки ЭКО/ИКСИ.
3) дифференциальная диагностика генетически обусловленных и функциональных форм патоспермии при астено- и тератозооспермии.
4) контроль спермы доноров, в том числе криотолерантности.
Показания к применению ЭМИС:
• «идиопатическое» бесплодие (когда причина бесплодия не ясна, а результаты традиционного спермиологического исследования соответствуют нормативным);
• наличие спонтанных абортов в анамнезе жены;
• нарушение подвижности (астенозооспермия) или морфологии (тератозооспермия) сперматозоидов;
• перед применением методов репродуктивных технологий (инсеминации, ИКСИ - интрацитоплазматическое введение сперматозоидов, ЭКО-экстракорпорального оплодотворения).
Электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов (ЭМИС) при нарушении структуры хроматина сперматозоидов и тест на фрагментацию ДНК сперматозоидов.
В норме хроматин сперматозоидов представляет собой плотную гомогенную массу, в которой не различаются гранулы и фибриллы. При нарушении структуры хроматина в ядре выявляются гранулы высокой электронной плотности диаметром 25 - 50 нм, соединенные в фибриллы менее электронно-плотными зонами. Для таких ядер употребляется термин “незрелый хроматин”, так как такое строение имеют ядра незрелых половых клеток – удлиненных сперматид. Незрелый гранулярно-фибриллярный хроматин выявлялся в сперматозоидах как с нормальной, так и с аморфной формой головки.
У доноров спермы содержание сперматозоидов с недостаточно конденсированным «незрелым» хроматином не превышает 30%. У пациентов с нарушениями фертильности и, в большей степени, у пациентов, жены которых имеют спонтанный аборт в анамнезе, доля таких сперматозодов может достигать 85%.
Фрагментация ДНК сперматозоидов (ФДС) является другой частой причиной аномального перенесения ДНК потомству. Сперматозоиды с ФДС находят в высоком проценте у суб- и инфертильных мужчин, у курильщиков, пожилых мужчин, лиц под действием токсикантов или радиохимиотерапии.
ФДС может быть результатом апоптоза (теория абортивного апоптоза), результатом нарушений репарации ДНК при репрограммировании хроматина (теория аномальной конденсации), при выходе сперматозоидов из семенников основной опасностью является оксидативный стресс, вызывающий фрагментацию ДНК и окисление оснований ДНК.
Метод, применяемый для определения ФДС - TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase - mediated fluorescein-dUTP nick-end labelling) основан на маркировке флюоресцентным дезоксиуридином свободных двухцепочечных концов ДНК с применением фермента концевой дезоксинуклеотидил трансферазы (TdT). Метод предполагает подсчет числа TUNEL-позитивных клеток c помощью люминесцентного микроскопа либо подсчет клеток на проточном цитофотометре. Нормативные показатели содержания сперматозоидов с фрагментацией ДНК – 15% .
Незрелый хроматин – особая форма патологии спермиогенеза, не связанная с разрывами ДНК, подвижностью или гибелью клеток. Данные научной литературы (Henkel et al., 2010) свидетельствуют об отсутствии положительной корреляции между количеством сперматозоидов с разрывами ДНК (фрагментация ДНК) и сперматозоидов с незрелым хроматином. Наличие в эякуляте большого количества сперматозоидов, содержащих не репарированные разрывы ДНК, является самостоятельным диагностическим признаком. Этот параметр прямо не связан повышением количества сперматозоидов с «незрелым» хроматином, хотя клинически и то, и другое нарушение является причиной повышенного риска спонтанного аборта в первом триместре беременности.
При выявлении в эякуляте мужчин повышенного содержания сперматозоидов с аномальной упаковкой хроматина клиницисты могут применять определенные виды терапии для нормализации структуры хроматина – терапия препаратами фолликулостимулирующего гормона (ФСГ-терапия), антиоксидантная терапия, рекомендации по образу жизни пациентов, выявление урогенитальных инфекций (чаще всего хламидии, уреаплазмы).
ЭМИС как альтернативный пенетрационный тест.
Этот показатель может быть использован как альтернатива так называемым «пенетрационным» тестам, которые рекомендует использовать Руководство ВОЗ. Пенетрационные тесты позволяют выявлять функцию акросомы, которая необходима для проникновения через оболочки ооцита. Среди таких тестов можно назвать акросомную реакцию, тест связывания сперматозоидов с блестящей оболочкой ооцита (HZA - hemizona assay) (Oehninger et.al.,1989), тест проникновения сперматозоидов сквозь блестящую оболочку ооцита (Lanzendorf et.al.,1994), тест проникновения сперматозоидов в ооцит, лишенный оболочки (Aitken et.al., 1991). В настоящее время в РФ пенетрационные тесты, рекомендованные ВОЗ, проводятся в единичных центрах репродукции, и не используются при диагностике бесплодия мужчин в андрологических клиниках.
Выявление в эякуляте повышенного содержания (более 20%) сперматозоидов с прореагировавшей акросомой позволяет
рекомендовать клиницистам применение соответствующего курса терапии. Обычно у таких пациентов даже при отсутствии клинических симптомов выявляется воспалительный процесс органов урогенитального тракта. При электронно-микроскопическом исследовании часто выявляются бактериальные микроколонии (неспецифическая микрофлора, наличие которой не определяется при обследовании по поводу бесплодия). Лечение воспалительных заболеваний и антиоксидантная терапия позволяет нормализовать структуру акросомы.
Применение ЭМИС для дифференциальной диагностики генетически обусловленных и функциональных нарушений жгутикового аппарата сперматозоидов у пациентов с астенозооспермией.
ЭМИС позволяет дифференцировать генетически обусловленную первичную патологию двигательного аппарата жгутиков от вторичной, что важно для выявления риска наследования генетических дефектов. Генетически обусловленная патология строения жгутиков, так называемая первичная цилиарная дискинезия (ПЦД) - достаточно редкое заболевание, примерно 0,2 – 2% от всей популяции мужчин, страдающих бесплодием. Жгутиковый аппарат сперматозоидов имеет сложное комплексное строение. В настоящее время единственным тестом, позволяющим выявлять нарушения морфологии основного компонента жгутика – аксонемы и подтверждающим диагноз ПЦД, является ЭМИС.
Важность выявления этой патологии обусловлена тем, что велик риск наследования патологии. Наследование аномалий жгутиков – это не только причина наследственного бесплодия, но также и риск проявление в потомстве врожденных бронхо-легочных и сердечно-сосудистых заболеваний, частота которых у лиц с ПЦД примерно в 200 раз выше, чем в среднем по популяции. Поэтому при выявлении ПЦД пациентам разъясняется риск наследования и рекомендуется использование донорских сперматозоидов.
Выявление герпетическго инфицирования сперматозоидов.
Доказано существование внутрилеточного герпетического инфицирования сперматозоидов мужчин, не имеющих симптомов генитального герпеса, которые не обращаются по поводу этого заболевания к клиницистам и не получают лечения. Это явление может иметь как эпидемиологическое значение - горизонтальная передача вируса простого герпеса при бессимптомном носительстве, так и играть роль в аномалиях развития беременности и в нарушениях фертильности.
Внутригаметное герпетическое инфицирование сперматозоидов с помощью ЭМИС обнаружено у 65% пациентов, жены которых имели в анамнезе спонтанное прерывание беременности либо замершая беременность.
Выявление герпетического инфицирования является показанием для проведения специфической антигерпетической терапии по так называемой супрессивной схеме